二、重组展通過基因突變改善
SOD的人源性能hCu/Zn-SOD作為抗氧化酶能夠減輕活性氧自由基對細胞的損傷，且不會引起免疫反應，超氧但是化物hCu/Zn-SOD的大規模生產和臨床使用受到產量和可溶性的限製。通過定點突變改變hCu/Zn-SOD的歧化一些氨基酸殘基可以改善其產量和品質。
hCu/Zn-SOD包含2個亞基，酶研每個亞基又包含4個半胱氨酸（Cys）殘基，究进其對應的重组展位置分別是6、57、人源111和146，超氧其中Cys57和Cys146之間形成分子內二硫鍵，化物6位和111位是歧化遊離的半胱氨酸殘基。周讚虎等應用PCR定點突變技術把hCu/Zn-SOD基因的酶研Cys111密碼子突變為Ala111密碼子，通過隨機同源重組將突變後的究进hCu/Zn-SOD整合到聚球藻Synechococcussp.PCC7942中並實現表達，表達產物在80℃保溫30min後仍具有95%的重组展活力，耐熱能力比天然hCu/Zn-SOD有了較大的提高。張琨等通過重疊PCR技術將天然hCu/Zn-SOD基因的Cys6密碼子突變為Ala6密碼子，Cys111密碼子突變為Ser111密碼子，通過大腸杆菌重組表達得到改構體蛋白rmhCu/Zn-SOD6Ala,111Ser，從1g濕菌體中獲得的活性蛋白總量高於未改構體的2倍，改構體的熱穩定性也獲得大幅度提高。高淑彬分別構建天然hCu/Zn-SOD和Cys111突變成Ala111的突變hCu/Zn-SOD表達載體，並在大腸杆菌中表達，其表達量都占菌體總蛋白的45%以上，突變hCu/Zn-SOD酶活力和穩定性均高於天然hCu/Zn-SOD，證明通過基因突變可以改善酶的性能。通過隨機整合方式將突變的hCu/Zn-SOD基因整合到藍藻Synechoccussp.PCC7942染色體上，動物實驗證明轉突變hCu/Zn-SOD基因的藍藻口服後具有較強的抗氧化作用，為進一步研究開發半衰期長的可直接口服的hCu/Zn-SOD奠定了基礎。Zhang等將hCu/Zn-SOD的6位和111位的半胱氨酸（C）突變為絲氨酸（S），構建了3個突變體mhSOD1/C6S、mhSOD1/C111S和mhSOD1/C6S/C111S。結果表明，與野生型相比，除了C6S突變使重組蛋白可溶性表達降低以外，C111S和C6S/C111S突變均能增加重組蛋白在大腸杆菌中的可溶性表達，進而提高重組蛋白的產量，且C111S突變效果優於C6S/C111S。此外，mhSOD1/C111S顯示了更低的毒性和更強的美白和抗輻射活性。因此，C111S突變是工業化大規模生產和開發重組人源SOD的一個有效策略。
三、通過融合蛋白技術改善
SOD的性能融合蛋白技術是指利用基因工程技術，將兩段或多段編碼功能蛋白的基因有目的地連接在一起並進行表達，從而產生一種新的人工融合蛋白的方法。由相對較小的結構域拚裝成較大的多功能蛋白是自然進化的一個重要因素。因此，在基因水平上將不同的結構域進行連接，並且使其表達成融合蛋白，是形成多功能蛋白、降低原蛋白毒副作用及改造天然蛋白的重要方法。由於有新功能蛋白加入，融合蛋白的性能被優化，並產生新的生物功能和活性，所以這種新型的人工蛋白具有重要的理論意義和潛在的應用價值。
1、PTD-SOD融合蛋白
細胞膜上沒有專一的SOD通道或受體，外源SOD難以進入細胞內發揮抗氧化作用，因而限製了其臨床應用。HIV-1反式激活蛋白TAT的蛋白轉導結構域是一種廣譜的能攜帶大分子物質穿透動物細胞膜的小分子多肽，可以解決SOD蛋白透膜相關難題。PTD可以引導多種多肽和蛋白進入目標細胞，具有轉導速度快、效率高和溫度適應性廣等優點，且能夠透過血腦屏障。大部分PTD或與PTD共價結合的蛋白在跨過細胞膜後轉運到細胞核而不是細胞質或其他細胞器，因此PTD運輸係統隻適用於在細胞核內發揮功能的藥物分子的轉運。王宇等研究PTD4介導的Cu/Zn-SOD對大鼠心肌細胞缺氧-複氧損傷（HRI）的影響，發現重組的PTD4-Cu/Zn-SOD融合蛋白可以明顯減少HRI導致的細胞凋亡，從而減輕大鼠心肌細胞的HRI，證明了重組PTD4-Cu/Zn-SOD可以高效穿透心肌細胞，改善心肌細胞缺血再灌注損傷。Yao等在骨癌研究中發現，活性氧在一定程度上參與了腫瘤疼痛的發展和持續，而重組PTD-Cu/Zn-SOD可以減弱這種作用，因此其在骨癌治療中可作為一種潛在的輔助治療劑。Zhang等將所獲得的Mn-SOD、PTD-Mn-SOD和脂質體Mn-SOD用於保護人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）氧化損傷，結果發現，與天然Mn-SOD相比，PTD-Mn-SOD和脂質體Mn-SOD可發揮更強的藥理作用。孟麗華和薛榮亮通過檢測PTD4-Cu/Zn-SOD進入人星形膠質細胞內的熒光蛋白的分布情況，發現PTD4-Cu/Zn-SOD融合蛋白能夠穿過細胞膜，且可以降低因細胞缺氧損傷所致的細胞凋亡。PTD與SOD進行融合的方法簡單易行，可提供大量廉價、安全、高活性的重組SOD製品。需要強調的是，盡管PTD-Cu/Zn-SOD融合蛋白具有良好的穿透細胞膜特性，但沒有組織特異性，若是靜脈給藥可能會迅速導入血管內皮細胞或血細胞，不能很好地到達靶區發揮作用，因此需要進一步改進結構或給藥途徑以解決其靶向問題。
2、PEP-SOD融合蛋白
PEP-1是一種人工設計的主要用於轉導大分子蛋白的細胞穿透肽，它能高效率地攜帶具有治療效果的蛋白進入細胞並發揮其生物學效應。Liu等構建了表達PEP-1-hMnSOD融合蛋白的表達載體，並在雙歧杆菌中成功表達了PEP-1-hMnSOD融合蛋白。在進一步臨床研究中，將透膜性和穩定性較差的hMnSOD通過PEP-1遞送到結腸炎症細胞內，通過對炎症細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8水平以及結腸組織學損傷檢測，發現PEP-1-hMnSOD融合蛋白能夠有效地減輕葡聚糖硫酸鈉誘導的潰瘍性結腸炎。因此口服表達PEP-1-hMnSOD融合蛋白的雙歧杆菌工程菌可作為治療潰瘍性結腸炎的新方法。
神經幹細胞移植已被證明是一種潛在的治療創傷性腦損傷的策略。Jia等探索NSCs移植配合PEP-1-SOD1共同治療大鼠腦缺血的可能性。體外實驗證明，PEP-1-SOD1能提高神經幹細胞的增殖和分化；體內實驗表明，與單獨NSCs移植相比，PEP-1-SOD1聯合NSCs移植策略對大鼠TBI後的功能恢複有明顯的促進作用。Yoo等探討了Cu/Zn-SOD對脂肪組織來源間充質幹細胞抗脊髓缺血損傷的促進作用。結果顯示PEP-1-SOD1和Ad-MSCs聯合應用進一步增強了Ad-MSCs對神經元缺血損傷的保護作用。相對於PTD融合蛋白，PEP融合蛋白具有其獨特優勢。PTD融合蛋白進入細胞後，所攜帶的功能蛋白需要在細胞內分子伴侶HSP90的幫助下重折疊才能發揮其生物學效應，靶蛋白的生物活性依賴於細胞內HSP90的重折疊效率，因此PTD融合蛋白技術的臨床應用受到了一定限製。而PEP融合蛋白能夠直接攜帶具有生物活性的功能蛋白進入細胞發揮生物學效應，同時它還具有轉導效率高、無毒性及不受血清影響等優勢，這使細胞穿透肽PEP在應用上更具有潛力，可能成為更適合於蛋白治療的載體工具。
3、多功能融合蛋白
研究者們曾嚐試將不同功能的蛋白與SOD進行組合，將不同蛋白的優勢和特點融合在一起，以賦予目的蛋白多種新的屬性和功能。周宇飛等為了增強胸腺素α1（Thyα1）的穩定性和免疫功能，采用胸腺素α1與人源SOD融合的策略，構建了6His-hSOD-(G4S)1-Thyα1和6His-hSOD-(G4S)2-Thyα1兩個融合基因，並在畢赤酵母中實現了高水平表達。重組表達的融合蛋白經過進一步純化後進行了活性檢測，結果表明這兩個融合蛋白既有SOD的活性，又有Thyα1的活性。盛明明等采用基因工程技術通過大腸杆菌製備一種兼具人源SOD和過氧化氫酶（CAT）活性的多功能融合蛋白CAT-PTD-SOD，該融合蛋白大部分以兼具SOD和CAT活性的可溶形式存在。在0.033mol/L、甚至0.067mol/L的H2O2溶液中，SOD活性在20min內無明顯下降，證明其具備抗氧化和分解過氧化氫的雙重作用。潘劍茹等構建了SOD1和穿膜肽R9的融合蛋白表達質粒GST（穀胱甘肽巰基轉移酶）-SOD1-R9，通過大腸杆菌BL21（DE3）表達出具有雙效抗氧化功能的GST-SOD1-R9融合蛋白。該融合蛋白不僅能夠清除多餘的活性氧自由基，而且還能夠修複或清除體內已被氧化損傷的生物分子，並再生氧化損傷的含巰基蛋白。Pan等研究了GST-TAT-SOD對順鉑損傷細胞的保護作用，證明GST-TAT-SOD通過直接清除多餘的細胞內自由基和增強細胞抗氧化防禦，可以解除順鉑治療引起的生長抑製和細胞凋亡，因此GST-TAT-SOD可以作為順鉑誘導的細胞損傷的保護劑。此外，Pan等還通過小鼠全身X射線輻射實驗，表明雙功能GST-TAT-SOD對X射線輻射所致損傷有一定的防護作用，能夠有效提高小鼠脾髒和肝髒的抗氧化能力、脾髒白髓數目和胸腺指數等，不僅顯著提高了X射線輻照小鼠體重增長率，而且提高了接受致死量照射小鼠的存活率。GST-TAT-SOD的整體效果比阿米福汀好一些，所以GST-TAT-SOD可作為一種安全的輻射防護劑。
Luangwattananun等設計並研製了三功能融合蛋白CAT-CuZnSOD/6His-CuZnSOD-TAT（CS/S-TAT），與其之前設計的6His-MnSOD-TAT/CAT-MnSOD（M-TAT/CM）相比，分子大小減小42%，其SOD和CAT活性分別提高22%和99%。在70℃孵育10min後，CS/S-TAT保留了54%的殘餘SOD活性，而M-TAT/CM的SOD活性完全消除。此外，在70℃時，CS/S-TAT的半衰期比M-TAT/CM提高了5倍。該酶能夠跨膜進入哺乳動物細胞，可作為氧化損傷細胞的保護劑或治療劑。因此，這項工作為設計和合成一種更穩定的多功能抗氧化酶提供了參考。總之，多功能的融合蛋白在抗氧化方麵，往往比單一的抗氧化蛋白具有更大的優勢。因此，融合蛋白的巨大優勢使其有望成為新一代抗氧化藥物的有力競爭者，為開發高效率抗氧化蛋白開辟了新途徑。
四、總結與展望
SOD是生物體內一種重要的氧自由基清除劑，具有重要的生物學功能。許多疾病（如肌萎縮側索硬化、動脈硬化閉塞症、腫瘤轉移和感染性疾病等）的產生和發展與SOD缺乏或不正確折疊有關。隨著SOD研究不斷深入和工業化生產規模逐漸擴大，SOD還被應用於化學、生物學、食品科學和植物病害預防等多個領域。但是受天然SOD的理化性質所限，如靜脈注射後體內半衰期僅為6min，口服後在胃腸道中容易被破壞而失去療效，膜透過率低等，這些因素使其在應用方麵受到了很大的限製。目前，人們對SOD蛋白進行了化學修飾、人工有機合成SOD模擬物和運用基因工程法製備SOD等方麵的探索，普遍認為通過基因工程製備重組人源SOD是最為經濟、快捷、有效且安全的方法。隨著現代生物技術的快速發展，國內外在微生物發酵生產重組SOD的菌種選育、高產菌開發和發酵工藝的優化等方麵都取得了一定進展。通過基因工程技術生產重組人源SOD，既降低了其他來源SOD的免疫原性問題，又解決了人源SOD的來源問題，並且可以克服傳統工藝限製，使人們可以按照自己的意願定向改造目的蛋白。隨著研究的進一步深入，基於基因工程主導的生物工程將逐漸推進重組SOD實現產業化，利用SOD開發的產品也將會得到更為廣泛的應用。
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