取不同濃度的LCP溶液液各0.04mL，按試劑盒加入反應試劑一0.26mL、优化氧化研究試劑二0.32mL、川芎試劑三0.04mL、蛋白試劑四0.06mL，工艺混勻，及抗即為測定組。活性取等體積蒸餾水，面法同法製備對照組。优化氧化研究依上述方法，川芎不加試劑三，蛋白加蒸餾水補足體積，工艺混勻，及抗即為空白組。活性於37℃反應10min，面法轉移至玻璃比色皿中，蒸餾水調零，570nm讀取各組吸光度值A，平行測定3次，以VC為陽性對照組，如下公式（4）計算清除率。
式中：A1：對照組吸光度值，A2：測定組吸光度值，A3：空白組吸光度值。
分別吸取1.47mg/mL的LCP溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1mL，加80%甲醇補足至1mL，備用。取上述不同濃度的LCP溶液0.4mL，按試劑盒加入0.6mL工作液製，混勻，即得測定組。取0.4mL不同濃度的LCP溶液與0.6mL80%甲醇溶液為對照組。取0.4mL80%甲醇溶液與0.6mL工作液，充分混勻，即得空白組。室溫避光靜置30min使之充分反應，無水乙醇調零，於517nm讀取吸光度值A，每個濃度的樣品重複測定3次，取均值，以VC為陽性對照組，按公式（5）計算清除率。
式中：A1：測定組吸光度值，A2：對照組吸光度值，A3：空白組吸光度值。
實驗結果用平均值±標準差表示，采用Designexpert8.0.6進行響應麵實驗數據優化，用SPSS26.0軟件進行方差分析，以P＜0.05表示有統計學意義。
實驗結果見圖1（a），LCP得率先隨pH的增大而增大。推測在一定範圍內，增大pH，因形成羧基離子和去質子胺，蛋白質分子中含有更高的負電荷排斥力，使蛋白質和水分子之間的相互作用增加，而增加LCP的溶解度；亦可能是因偏離LCP的等電點，而增加LCP的溶解度，最終使LCP得率增大。pH6時LCP的得率為（2.23%±0.05%），而後LCP得率隨pH增大而減小。推測較高pH水平下提取樣品時，因增加澱粉及其他雜質物質的溶出，而稀釋LCP的濃度。且在堿性條件下，酚類化合物易從藥材中釋放並與蛋白質共價結合而後快速氧化，導致提取物的顏色呈褐色。經方差分析，P=0.002＜0.01，表明pH對LCP得率的影響有極顯著性。綜合考慮，選取提取液pH5～7進行響應麵法優化試驗。
從圖1（b）可發現，蛋白質得率因料液比的不同而差異明顯。料液比在1:5～1:15（g/mL）範圍內，蛋白質得率逐漸增加，這是由於隨著料液比的增大，溶液中分子擴散和碰撞速率加快，促進蛋白質分子的溶解。當料液比在1:15～1:25（g/mL）範圍內，得率逐漸下降，推測是由於料液比增大而致蛋白質分子分散性加大，不易酸沉獲得蛋白質，同時一些可溶性雜質溶解阻礙蛋白質溶出，且不利於獲得純度較好的蛋白質。經方差分析，P=0.032＜0.05，表明料液比對LCP得率的影響具有顯著性。綜合考慮，選取料液比1:10～1:20（g/mL）進行響應麵法優化試驗。
從圖1（b）可發現，蛋白質得率因料液比的不同而差異明顯。料液比在1:5～1:15（g/mL）範圍內，蛋白質得率逐漸增加，這是由於隨著料液比的增大，溶液中分子擴散和碰撞速率加快，促進蛋白質分子的溶解。當料液比在1:15～1:25（g/mL）範圍內，得率逐漸下降，推測是由於料液比增大而致蛋白質分子分散性加大，不易酸沉獲得蛋白質，同時一些可溶性雜質溶解阻礙蛋白質溶出，且不利於獲得純度較好的蛋白質。經方差分析，P=0.032＜0.05，表明料液比對LCP得率的影響具有顯著性。綜合考慮，選取料液比1:10～1:20（g/mL）進行響應麵法優化試驗。
在特定條件下，蛋白質浸出需要一定時間達到平衡狀態；時間較短，分子擴散效率一定，蛋白質溶出量有限；延長浸提時間蛋白質得率呈下降趨勢，可能是由於蛋白質長時間在堿性環境中會發生輕微水解和變性，而且時間延長也會增加非蛋白物質浸出，影響蛋白質進一步沉澱和蛋白製品的純度，且與同類豆類如豌豆、大豆和蠶豆相比，川芎富含不同的多糖，多糖與蛋白質的相互作用可能導致川芎中提取蛋白的價值降低。經方差分析，P=0.023＜0.05，表明提取時間對LCP得率的影響具有顯著性。綜合考慮，選取提取時間1～2h進行響應麵法優化試驗。
每組樣品平行測定3次，取平均值，並進行數據散點圖和統計分析。DesignExpert8.0.6軟件進行響應麵設計及結果分析。結果如表3所示，得擬合方程為
y=2.28+0.18A+0.21B+0.19C−0.055AB+0.078AC+0.13BC−0.47A2−0.34B2−0.54C2。
如表4所示，模型F=40.23，Pr＞F＜0.01，說明此回歸模型是極顯著的。方程失擬項F=0.89，Pr＞F＞0.05，失擬項相對於純誤差影響不顯著，說明回歸模型與實測值擬合度較好，適用性高，可以使用該回歸方程代替試驗真實點分析試驗結果。各因素的影響大小為：提取時間＜提取溶劑pH＜料液比。通過F檢驗來判定，概率P（F＞Fα）的值越小，則相應變量的顯著程度越高，對試驗指標的影響越大，PA、PB、PC均小於0.01，說明提取時間、料液比、提取溶劑pH對LCP得率的影響極顯著。R2=0.9810，R2Adj=0.9566，表示所建立的模型能夠很好地反映獨立變量和響應變量之間的關係。
聲明：本文所用圖片、文字來源《食品工業科技》，版權歸原作者所有。如涉及作品內容、版權等問題，請與本網聯係
相關鏈接：川芎，甲醇，乙醇
